В 1844 году он поступил в Казанский университет. В 1851 году Бутлеров защитил в Казанском университете магистерскую диссертацию "Об окислении органических соединений", а в 1854 году уже в Московском университете - докторскую диссертацию "Об эфирных маслах". Спустя четыре года молодой Бутлеров выступил на заседании Парижского химического общества с докладом "О конституции тел вообще", который был встречен с большим интересом и привлек внимание научной общественности.
Кроме университетских курсов, Бутлеров читал общедоступные лекции по химии, участвовал в работе Казанского экономического общества, публиковал статьи по ботанике, цветоводству, сельскому хозяйству. Большое значение для формирования научных интересов имела его командировка в 1857-58 в Европу, где Бутлеров ознакомился с лучшими химическими лабораториями и рядом химических предприятий.
Возвратившись в Казань, Бутлеров перестроил химическую лабораторию и продолжил исследования производных метилена. Открыв в 1858 г. новый способ синтеза иодистого метилена, выполнил серию работ, связанных с получением его производных. Синтезировал диацетат метилена, получил продукт его омыления - полимер формальдегида, а на основе последнего впервые получил (1861 г.) гексаметилентетрамин (уротропин) и сахаристое вещество "метиленитан", то есть осуществил первый полный синтез сахаристого вещества.
19 сентября 1861 года Александр Михайлович выступил на 36-м съезде немецких врачей и естествоиспытателей в городе Шпейер с докладом "О химическом строении вещества". Принципиально новым в его теории было положение о химическом (а не механическом) строении молекул (термин «химическое строение» принадлежит ему), под которым Бутлеров понимал способ соединения между собой составляющих молекулу атомов в соответствии с принадлежащим каждому из них определенным количеством химической силы (сродства). Бутлеров установил тесную связь между строением и химическими свойствами сложного органического соединения, что позволило ему доказать изомерию многих органических соединений, в том числе двух изомерных бутанов, трех пентанов и различных спиртов до амиловых включительно, а также объяснять и предсказывать возможные химические превращения. Бутлеров впервые объяснил явление изомерии тем, что изомеры - это соединения, обладающие одинаковым элементарным составом, но различным химическим строением. В свою очередь, зависимость свойств изомеров и вообще органических соединений от их химического строения объясняется существованием в них передающегося вдоль связей "взаимного влияния атомов", в результате которого атомы в зависимости от их структурного окружения приобретают различное "химическое значение".
Бутлеров предвидел, а затем и доказал существование позиционной и скелетной изомерии. Получив третичный бутиловый спирт, он сумел расшифровать его строение и доказал (совместно с учениками) наличие у него изомеров. В 1864 году Бутлеров предсказал существование двух бутанов и трех пентанов, а позднее и изобутилена. Александр Бутлеров впервые начал на основе теории химического строения систематическое исследование полимеризации, продолженное в России его последователями и увенчавшееся открытием С. В. Лебедевым промышленного способа получения синтетического каучука.
Огромная заслуга Бутлерова - создание первой русской школы химиков. Кроме химии, Бутлеров много внимания уделял практическим вопросам сельского хозяйства, садоводству, пчеловодству, а позднее также и разведению чая на Кавказе.
Во время третьей поездки за границу (1867-68) Бутлеров был избран профессором химии Петербургского университета. Вскоре он был избран экстраординарным (1871), а затем и ординарным (1874) академиком Петербургской АН. В петербургский период жизни Бутлеров продолжал экспериментальные работы, занимался совершенствованием теории химического строения В 1880-83 Бутлеров — президент Русского физико-химического общества.
В 1875 Бутлерову, после 25-летней службы, полагалась отставка, но Совет Петербургского университета дважды отодвигал этот срок на 5 лет. Последнюю лекцию Бутлеров прочитал 14 марта 1885.
Умер ученый от закупорки кровеносных сосудов 5 августа 1886 года.